Диагностика анемии Фанкони: полное руководство

Анемия Фанкони (АФ) – редкое генетическое заболевание, характеризующееся прогрессирующей недостаточностью костного мозга, различными врожденными аномалиями и повышенной предрасположенностью к развитию злокачественных новообразований, особенно острого миелоидного лейкоза (ОМЛ) и солидных опухолей. Ранняя и точная диагностика АФ имеет решающее значение для своевременного начала лечения и улучшения прогноза. Эта статья представляет собой подробное руководство по диагностике АФ, охватывающее клинические проявления, лабораторные исследования и генетическое тестирование.

## Клинические проявления анемии Фанкони

Анемия Фанкони характеризуется широким спектром клинических проявлений, варьирующихся по степени выраженности у разных пациентов. Некоторые пациенты могут иметь выраженные врожденные аномалии, в то время как другие могут иметь лишь незначительные отклонения или вовсе не иметь их. Заболевание может проявляться в любом возрасте, но чаще всего диагностируется в детстве или подростковом возрасте.

### Врожденные аномалии

Признаки, которые могут указывать на АФ:

* **Аномалии скелета:**
* Отсутствие или недоразвитие лучевой кости (одна из костей предплечья).
* Аномалии большого пальца (отсутствие, гипоплазия, искривление).
* Аномалии верхних конечностей (короткие руки, деформация плечевого пояса).
* Аномалии нижних конечностей (вывих бедра, косолапость).
* Низкий рост.
* Сколиоз.
* **Аномалии кожи:**
* Пятна цвета «кофе с молоком» (гиперпигментация).
* Гипопигментация.
* **Аномалии глаз:**
* Микрофтальмия (маленький глаз).
* Косоглазие.
* Катаракта.
* **Аномалии почек:**
* Подковообразная почка.
* Отсутствие одной почки.
* Гидронефроз.
* **Аномалии сердца:**
* Дефекты межпредсердной перегородки.
* Дефекты межжелудочковой перегородки.
* **Другие аномалии:**
* Микроцефалия (маленький размер головы).
* Задержка умственного развития.
* Аномалии желудочно-кишечного тракта.
* Аномалии половых органов (гипогонадизм, крипторхизм).

### Гематологические проявления

Недостаточность костного мозга является основным гематологическим проявлением АФ. Она проявляется в виде:

* **Анемии:** Снижение количества эритроцитов, приводящее к усталости, слабости, бледности кожи и одышке.
* **Тромбоцитопении:** Снижение количества тромбоцитов, повышающее риск кровотечений и кровоизлияний.
* **Нейтропении:** Снижение количества нейтрофилов, увеличивающее восприимчивость к инфекциям.
* **Панцитопении:** Снижение количества всех трех типов клеток крови (эритроцитов, тромбоцитов и лейкоцитов). Пациенты с АФ имеют повышенный риск развития миелодиспластического синдрома (МДС) и острого миелоидного лейкоза (ОМЛ).

## Лабораторные исследования

Диагностика АФ включает в себя ряд лабораторных исследований, направленных на оценку кроветворения, выявление хромосомных аномалий и подтверждение диагноза с помощью генетического тестирования.

### Общий анализ крови

Общий анализ крови (ОАК) является первым шагом в диагностике АФ. Он позволяет оценить количество различных клеток крови (эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов) и выявить признаки недостаточности костного мозга. При АФ в ОАК могут быть обнаружены:

* Снижение количества эритроцитов (анемия).
* Снижение количества тромбоцитов (тромбоцитопения).
* Снижение количества нейтрофилов (нейтропения).
* Повышение среднего объема эритроцитов (макроцитоз).

### Миелограмма

Миелограмма – это исследование костного мозга, которое позволяет оценить клеточный состав и структуру костного мозга. При АФ в миелограмме могут быть обнаружены:

* Гипоплазия костного мозга (снижение количества клеток).
* Дисплазия клеток (аномальное строение клеток).
* Повышенное количество незрелых клеток (бластов).

### Тест на хромосомную нестабильность (тест с диэпоксибутаном – ДЭБ)

Тест на хромосомную нестабильность является ключевым диагностическим тестом для АФ. Он основан на повышенной чувствительности клеток АФ к ДЭБ и митомицину С (ММС), веществам, которые повреждают ДНК.

**Методика проведения теста ДЭБ:**

1. **Забор крови:** У пациента берут образец крови (обычно 5-10 мл) в пробирку с гепарином (антикоагулянт). Важно использовать пробирку с гепарином, а не с ЭДТА, так как ЭДТА может влиять на результаты теста.
2. **Выделение лимфоцитов:** Из образца крови выделяют лимфоциты. Лимфоциты являются типом белых кровяных клеток, которые используются для проведения теста.
3. **Культивирование лимфоцитов:** Лимфоциты культивируют (выращивают) в специальной питательной среде в течение 72 часов. Культивирование позволяет клеткам делиться и размножаться, что необходимо для анализа хромосом.
4. **Добавление ДЭБ:** Во время культивирования к части лимфоцитов добавляют ДЭБ в определенной концентрации (обычно 0,05-0,1 мкг/мл). Другую часть лимфоцитов культивируют без добавления ДЭБ (контроль).
5. **Добавление колхицина:** За 2 часа до окончания культивирования к лимфоцитам добавляют колхицин. Колхицин останавливает деление клеток на стадии метафазы, когда хромосомы наиболее четко видны.
6. **Приготовление препаратов хромосом:** По окончании культивирования лимфоциты обрабатывают гипотоническим раствором (например, 0,075 М раствором KCl), чтобы клетки набухли и хромосомы лучше разошлись. Затем клетки фиксируют раствором фиксатора (например, смесью метанола и уксусной кислоты в соотношении 3:1).
7. **Окраска хромосом:** Препараты хромосом окрашивают специальными красителями (например, красителем Гимзы) для визуализации хромосом.
8. **Анализ хромосом:** Препараты хромосом анализируют под микроскопом. Подсчитывают количество хромосомных аберраций (разрывов, обменов и других аномалий) в клетках, культивированных с ДЭБ, и в контрольных клетках.

**Интерпретация результатов теста ДЭБ:**

* **Положительный тест:** Значительное увеличение количества хромосомных аберраций (разрывов, обменов) в клетках, культивированных с ДЭБ, по сравнению с контрольными клетками. Положительный тест указывает на АФ.
* **Отрицательный тест:** Количество хромосомных аберраций в клетках, культивированных с ДЭБ, не отличается от количества аберраций в контрольных клетках. Отрицательный тест не исключает АФ полностью, так как у некоторых пациентов с мозаичной формой АФ тест может быть отрицательным. В таких случаях необходимо проведение генетического тестирования.
* **Ложноположительные результаты:** Могут возникать при вирусных инфекциях, воздействии некоторых лекарственных препаратов или при других генетических заболеваниях.

**Важные моменты при проведении теста ДЭБ:**

* Строгое соблюдение протокола проведения теста.
* Использование свежих реактивов.
* Опытный персонал для анализа хромосом.
* Проведение контрольных исследований для исключения ложноположительных результатов.

### Проточная цитометрия для определения моноубиквитинирования FANCD2

Проточная цитометрия является современным методом, который может использоваться для диагностики АФ. Этот метод основан на определении моноубиквитинирования белка FANCD2 в клетках крови. Моноубиквитинирование FANCD2 является ключевым этапом в активации пути репарации ДНК, который нарушен при АФ.

В норме после повреждения ДНК белок FANCD2 модифицируется путем присоединения к нему молекулы убиквитина (моноубиквитинирование). Эта модификация необходима для активации белка FANCD2 и его участия в репарации ДНК. При АФ, из-за мутаций в генах пути Фанкони, моноубиквитинирование FANCD2 нарушено или отсутствует.

**Методика проведения проточной цитометрии для определения моноубиквитинирования FANCD2:**

1. **Забор крови:** У пациента берут образец крови (обычно 2-5 мл) в пробирку с ЭДТА (антикоагулянт).
2. **Выделение мононуклеарных клеток:** Из образца крови выделяют мононуклеарные клетки (лимфоциты и моноциты) с помощью центрифугирования в градиенте плотности (например, Ficoll-Paque).
3. **Фиксация и пермеабилизация клеток:** Клетки фиксируют (например, формальдегидом) для сохранения их структуры и пермеабилизуют (например, Triton X-100) для обеспечения доступа антител внутрь клеток.
4. **Инкубация с антителами:** Клетки инкубируют с антителами, специфичными к моноубиквитинированному FANCD2 (например, моноклональные антитела, конъюгированные с флуоресцентным красителем).
5. **Анализ на проточном цитометре:** Клетки анализируют на проточном цитометре. Проточный цитометр – это прибор, который позволяет измерять флуоресценцию отдельных клеток, проходящих через лазерный луч. Интенсивность флуоресценции пропорциональна количеству моноубиквитинированного FANCD2 в клетке.

**Интерпретация результатов проточной цитометрии:**

* **Снижение или отсутствие моноубиквитинирования FANCD2:** У пациентов с АФ наблюдается снижение или отсутствие моноубиквитинирования FANCD2 в мононуклеарных клетках по сравнению с контрольными образцами.
* **Нормальное моноубиквитинирование FANCD2:** У пациентов без АФ наблюдается нормальный уровень моноубиквитинирования FANCD2.

**Преимущества проточной цитометрии:**

* **Высокая чувствительность и специфичность:** Метод позволяет выявлять даже небольшие нарушения моноубиквитинирования FANCD2.
* **Быстрота выполнения:** Анализ занимает несколько часов.
* **Возможность анализа большого количества клеток:** Метод позволяет анализировать тысячи клеток, что повышает точность результатов.

### Генетическое тестирование

Генетическое тестирование является наиболее точным методом диагностики АФ. Оно позволяет выявить мутации в генах, ответственных за развитие заболевания. В настоящее время известно более 23 генов, мутации в которых могут приводить к развитию АФ, включая *FANCA, FANCB, FANCC, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, FANCI, FANCL, FANCM, FANCN/PALB2, FANCO/RAD51C, FANCP/SLX4, FANCQ/ERCC4, FANCR/RAD51, FANCS/BRCA1, FANCT/UBE2T, FANCU/XRCC2, FANCV/MAD2L2, FANCW/RFWD3, FANCX/POLR3A, FANCD1/BRCA2, FANCV/REV7*.

**Методы генетического тестирования:**

* **Секвенирование по Сэнгеру:** Этот метод позволяет определить последовательность ДНК в отдельных генах. Он используется для выявления известных мутаций или для поиска новых мутаций в генах АФ.
* **Секвенирование нового поколения (NGS):** Этот метод позволяет одновременно секвенировать множество генов или даже весь геном. Он используется для выявления мутаций в нескольких генах АФ одновременно, что особенно полезно, когда клиническая картина не позволяет точно определить, какой ген может быть мутирован.
* **MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification):** Этот метод используется для выявления крупных делеций или дупликаций в генах АФ. Он позволяет определить, отсутствует ли часть гена или присутствует в нескольких копиях.

**Интерпретация результатов генетического тестирования:**

* **Выявление мутации в одном из генов АФ:** Подтверждает диагноз АФ.
* **Выявление двух мутаций в одном из генов АФ (у пациента с аутосомно-рецессивной формой АФ):** Подтверждает диагноз АФ.
* **Выявление одной мутации в гене FANCB (у пациента мужского пола с Х-сцепленной формой АФ):** Подтверждает диагноз АФ.
* **Отсутствие мутаций в известных генах АФ:** Не исключает диагноз АФ, так как могут существовать еще не идентифицированные гены, мутации в которых могут приводить к развитию заболевания. В таких случаях необходимо проведение дополнительных исследований.

## Дифференциальная диагностика

Диагностика АФ требует исключения других заболеваний, которые могут иметь сходные клинические и лабораторные проявления. К таким заболеваниям относятся:

* **Анемия Даймонда-Блекфена:** Характеризуется изолированной эритроцитарной аплазией костного мозга. В отличие от АФ, при анемии Даймонда-Блекфена отсутствуют хромосомные аберрации и мутации в генах АФ.
* **Врожденный дискератоз:** Характеризуется аномалиями кожи, ногтей и слизистых оболочек. В отличие от АФ, при врожденном дискератозе отсутствуют аномалии скелета и хромосомные аберрации.
* **Синдром Швахмана-Даймонда:** Характеризуется экзокринной недостаточностью поджелудочной железы, нейтропенией и аномалиями скелета. В отличие от АФ, при синдроме Швахмана-Даймонда отсутствует повышенная чувствительность к ДЭБ и ММС.
* **Миелодиспластический синдром (МДС):** Характеризуется дисплазией клеток крови и повышенным риском развития лейкоза. В отличие от АФ, МДС обычно развивается в более старшем возрасте и не сопровождается врожденными аномалиями.

## Алгоритм диагностики анемии Фанкони

1. **Клиническая оценка:** Оценка наличия врожденных аномалий и гематологических проявлений.
2. **Общий анализ крови:** Оценка количества клеток крови (эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов).
3. **Миелограмма:** Оценка клеточного состава и структуры костного мозга.
4. **Тест на хромосомную нестабильность (тест с ДЭБ):** Оценка чувствительности клеток к ДЭБ и ММС.
5. **Проточная цитометрия для определения моноубиквитинирования FANCD2:** (Альтернативный/дополнительный метод)
6. **Генетическое тестирование:** Выявление мутаций в генах АФ.

## Заключение

Диагностика анемии Фанкони требует комплексного подхода, включающего клиническую оценку, лабораторные исследования и генетическое тестирование. Ранняя и точная диагностика позволяет своевременно начать лечение и улучшить прогноз для пациентов с этим редким и серьезным заболеванием. Внедрение новых методов диагностики, таких как проточная цитометрия для определения моноубиквитинирования FANCD2, способствует более быстрой и точной постановке диагноза. Важно помнить о дифференциальной диагностике с другими заболеваниями, имеющими сходные проявления. Современные методы генетического тестирования позволяют выявлять мутации в различных генах, ответственных за развитие АФ, что является важным для подтверждения диагноза и планирования лечения.